一、實驗前準(zhǔn)備工作：
 
1、培育瓶的包被：包被液如多聚賴氨酸或纖維粘連蛋白，以無菌水稀釋至2 ug/cm2的濃度包被培育瓶。37度孵箱1小時或4度過夜，從包被好的培育瓶中收回多聚賴氨酸，并用無菌水洗刷培育瓶2遍。包被好的培育瓶不要放置超過24小時，其中的包被液可吸出重復(fù)使用2-3次，留意不要污染。


2、*培育基的配置：以內(nèi)皮細胞培育基為例，把配套的胎牛血清、生長因子和雙抗參加根底培育液中。重新貼好標(biāo)簽，并混勻培育基。

二、原代細胞復(fù)蘇辦法：

1、從液氮中取出原代細胞冷凍管，迅速投入37～38 ℃水浴中，其間能夠悄悄滾動細胞，加速消融速度，大約需求1分鐘時刻。

2、5分鐘內(nèi)用培育基稀釋至原體積的10倍以上，參加培育瓶中，再用1ml培育基洗刷細胞凍存管，確保細胞都被參加培育瓶中，靜置于孵箱，12-16小時后替換培育基（除去DMSO）。今后每2天換一次液，確保細胞狀況杰出。

三、原代細胞傳dai辦法：酶消化法

當(dāng)細胞生長至70-80%左右能夠傳代，傳代份額以1:2或1:3為佳。具體辦法如下：

1、棄去培育瓶中培育基，用PBS洗刷培育瓶2遍，參加0.25%的胰酶消化液，以消化液能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn)。37度孵育4分鐘左右，輕拍培育瓶旁邊面，顯微鏡下觀察細胞消化狀況，直到80%細胞呈現(xiàn)圓形。

2、細胞消化好后，參加胰酶中和液，并悄悄搖擺培育瓶，形成細胞懸液，然后將細胞和培育基轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘。
 
3、棄去上清液，以1-2ml新鮮培育基重新懸浮細胞并吹打均勻，接種于包被好的新培育瓶中，瓶中已有10ml左右的培育基，放入培育箱中培育，每2天替換培育基。